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En Maldita.es ya explicamos la diferencia entre test rápidos y pruebas PCR para diagnosticar COVID-19. Ahora nos habéis preguntado qué diferencia a unas PCRs de otras entre las que se usan para diagnosticar la COVID-19. Os lo explicamos.
La técnica de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa en inglés) es una de las más comunes en los laboratorios de biomedicina y microbiología de todo el mundo. Permite replicar cadenas específicas de ADN millones de veces a través de reacciones rápidas controladas por la temperatura.
De esta manera, los científicos obtienen un ingente número de copias idénticas de un mismo fragmento de ADN que les interesa estudiar, y lo hacen mucho más fácil de detectar. En 1993 Kary Mullis y Michael Smith obtuvieron el Premio Nobel de Medicina por este hallazgo que ha acelerado la investigación científica desde entonces.
Sin embargo, existen diferentes variaciones de esta técnica básica. Nos centraremos en las que tienen algún tipo de relación con la COVID-19.
¿Cuáles son las variantes de la técnica de PCR que se usan para encontrar el SARS-CoV-2?
La principal y más importante variante de esta prueba se llama PCR en tiempo real o cuantitativa (Real-time PCR o qPCR). Esta PCR sirve para visualizar “en tiempo real” la progresión de esta reacción y cuantificarla a la vez.
¿Qué se necesita para realizarla?
- La muestra de ADN donde se encuentra la secuencia que nos interesa.
- Unos primers o marcadores, es decir, señales que identifiquen la secuencia específica de ADN que se quiere replicar.
- La enzima polimerasa, que sirve para replicar esa secuencia.
- Un tampón que contiene nucleótidos, es decir "los ladrillos” con los que tenemos que construir las copias del ADN buscado.
- Fluoróforos de detección, compuestos que actúan como pequeñas lucecitas de Navidad: en el momento en que los primers identifican las cadenas buscadas en la muestra, se enganchan a dichas cadenas y brillan, permitiendo contar cuántos fragmentos de ADN de interés hay.
“La reacción desarrolla una señal de fluorescencia cuya intensidad aumenta exponencialmente a cada ciclo de amplificación de manera proporcional a la cantidad de material genético en la muestra”, explica Mimma Marchese del Centro Nacional de Análisis Genómico (CNAG-CRG) de Barcelona a Maldita.es.
Benedetta Bolognesi, del Instituto de Bioingeniería IBEC de Barcelona, añade que “puedes monitorear la reacción en una máquina que lee cómo aumenta la fluorescencia en el tiempo y la convierte en una curva que se puede ver”.
Este es uno de los tipos de PCR que se utilizan para saber si una persona se ha infectado de COVID-19. En este caso concreto, los primers identifican los genes que codifican dos proteínas específicas del virus. Si la muestra proviene de una persona infectada, la PCR identificará el material genético viral y se enganchará a la secuencia genética buscada. Si se supera un determinado umbral predeterminado de luminosidad emitida por los fluoróforos, podremos decir que la persona está infectada.
Sin embargo, en el caso del virus SARS-CoV-2, hay que añadir una fase previa.
La PCR que se usa si el material genético está formado por ARN
Como ya sabemos, el virus SARS-CoV-2 es un retrovirus, es decir que su material genético está constituido por ARN. En este caso, pues, hay que hacer un paso anterior: convertir la molécula de ARN del virus en ADN mediante otra enzima: la transcriptasa.
Por todo eso, para efectuar los tests diagnósticos para COVID-19, se usa una segunda variante de la técnica PCR, llamada RT-qPCR, es decir Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa con Transcriptasa Inversa.
La molécula de ADN que produce la transcriptasa es complementaria al ARN del virus. Una vez obtenida ya se pueden identificar las secuencias específicas que generan las dos proteínas que delatan la presencia del virus, como explicábamos antes.
La RT-qPCR se puede hacer en dos etapas, primero la RT y después la qPCR, o en una única etapa, en el que se añaden todos los componentes necesarios para las dos reacciones, la transcripción inversa y después la amplificación.
Tanto Marchese como Bolognesi trabajan en centros donde se van a llevar a cabo estas pruebas. Marchese explica que, además de los equipamientos adecuados para llevar a cabo las técnicas "lo más importante en el caso de test diagnósticos es tener controles internos, positivos y negativos, que permitan excluir ‘falsos negativos’ debido a problemas técnicos del protocolo, y ‘falsos positivos’ debido a contaminaciones externas”.
La PCR de alta fidelidad, útil para secuenciar el virus
Las dos técnicas mencionadas son suficientemente precisas para realizar diagnósticos, pero cuando se quiere estudiar el propio virus, hace falta afinar todavía más los resultados.
Por eso es utiliza la PCR de alta fidelidad, o High fidelity PCR. Esta PCR difiere de la anterior por la precisión, o fidelidad, con la que la polimerasa es capaz de replicar la secuencia de ADN de la muestra, pero es más lenta y costosa.
Esta es la versión de la prueba que se ha utilizado en las investigaciones que han obtenido la secuenciación completa del ARN del virus. En este caso es muy importante que las copias del ADN complementario al ARN viral sean muy precisas. De esta forma, los investigadores fueron capaces de obtener una secuenciación completa del virus en las primeras semanas de la pandemia.
Primera fecha de publicación de este artículo: 24 de abril de 2020.
